Agrobacterium-mediated Nuclear Transformation of Haptophyte and Rhodophyte Species

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2017-06-19
Issue Year
2017
Authors
Prasad, Binod
Editor
Abstract

Microalgae are a promising, but widely unexploited source for the sustainable produc¬tion of novel compounds, which find application in food, feed, pharma¬ceutical and cosmetic industries, as well as for biofuel production. The haptophyte Pavlova lutheri possesses a great nutritional value as it synthesizes and accumulates higher amounts of very long chain polyunsaturated fatty acids (vLC-PUFAs). Also, the rhodophyte Porphyridium purpureum is considered as one of the economically important strain since it produces fluorescent phycobiliproteins, exopolysaccharides, vLC-PUFAs, carotenoids and vitamins. However, successful nuclear transformation has not been for realized for these industrially important microalgae for exploiting their potential into a sizeable market. This study reports an efficient nuclear transformation protocol for the metabolic engineering of P. lutheri and P. purpureum. Initial studies were performed to standardize co-cultivation medium and determine the sensitivity of the microalgae to selective agents. Both cultures bleached in artificial seawater (ASW) medium containing micromolar concentrations of the herbicide norflurazon. A mutated genomic phytoene desaturase (pds) gene from Haematococcus pluvialis was cloned as a selectable marker into the binary vectors pCAMBIA 1301 and 1380 for the genetic transformation of microalgae. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of P. lutheri and P. purpureum with the vector pCAMBIA 1301-pds-L504R and pCAMBIA 1380-pds-L504R yielded norflurazon-resistant cells. The effects of different factors that are known to influence the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation were accessed: co-cultivation medium, acetosyringone concentration and co-cultivation period. Co-cultivation of P. lutheri with A. tumefaciens harboring pCAMBIA 1301-pds-L504R in ASW medium containing 100 µM acetosyringone at 25 ± 1ºC and under 10 ± 2 µmol m-2 s-1 of light intensity for 24 h resulted in the highest number of norflurazon-resistant P. lutheri cells. For P. purpureum, ASW+IM medium, 300 µM of acetosyringone and 72 h co-cultivation period appeared to be the optimum co-cultivation parameters. The norflurazon-resistant cells kept their resistance phenotype for at least 24 months, even in the absence of selective pressure. These results clearly demonstrate the successful application of the pds gene as dominant selectable marker for P. lutheri and P. purpureum. However, the genomic clone of PDS gene harbors several introns and the entire expression cas¬sette including its native promoter and terminator has a length more than 6 kb, making it unsuita¬ble as a standard selection marker. Therefore, a synthetic pds gene (syn-pds-int) was constructed by adding suitable restriction sites for cloning purposes, removing unwanted internal restriction sites and introns, and introducing the first intron from the Chlamydomonas reinhardtii rbcS2 gene close to the 5´end without changing the amino acid sequence. The syn-pds-int gene was cloned into pCAMBIA 1380 under the control of its native promoter and used as a tool for the Agrobacterium-mediated genetic engineering of P. purpureum. The transformation efficiency and the lethal norflurazon dosage of the syn-pds-int construct were found to be similar to the genomic clone of pds gene, indicating that the synthetic construct of the pds gene retained its function even after modification. The integration of the introduced gene into the nuclear genome of P. lutheri and P. purpureum was shown by PCR amplification of the T-DNA sequences from the genomic DNA of norflurazon-resistant cells and Southern blot analysis using T-DNA sequences as probes. The transgene expressed efficiently as evidenced by the results of stability and tolerance study, and qRT-PCR analysis. Furthermore, the expression of the pds gene enhanced the intracellular carotenoid accumulation of transformants, opening up the possibility of enhancing the productivity of commercial carotenoids in eukaryotic microalgae by molecular engineering. In summary, an easy and reliable genetic transformation method for the marine microalgae P. lutheri and P. purpureum was developed. Establishment of the A. tumefaciens-mediated transformation protocol and the resistant marker gene (syn-pds-int) would be useful in further genetic modification of these and other biotechnologically promising microalgae species.

Abstract

Mikroalgen sind vielversprechende Kandidaten für die nachhaltige Produktion wichtiger Substanzen für die Lebensmittel-, Futter-, Pharma- und Kosmetikindustrie sowie für die Erzeugung biologischer Treibstoffe. So hat die haptophytische Alge Pavlova lutheri einen hohen Nährwert und reichert große Mengen von sehr langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren an (very long chain polyunsaturated fatty acids: vLC-PUFAs). Auch die Rotalge Porphyridium purpureum wird als wirtschaftlich bedeutend angesehen, da sie fluoreszierende Phycobiliproteine, Exopolysaccharide, vLC-PUFAs, Carotinoide und Vitamine produziert. Allerdings konnten diese für die Industrie bedeutenden Algenarten noch nicht erfolgreich transformiert werden, um ihr Marktpotenzial voll auszuschöpfen. Im Rahmen dieser Studie wurden effiziente Agrobacterium tumefaciens-basierte Transformationsprotokolle für P. lutheri und P. purpureum für biotechnologische Anwendungen entwickelt. Zunächst wurden Experimente zur Standardisierung des Co-Kultivierungsmediums sowie zur Bestimmung der Empfindlichkeit der Algen gegenüber Selektionssubstanzen durchgeführt. Beide Algenstämme bleichen im künstlichen Meerwassermedium (artificial seawater (ASW)) in Gegenwart von mikromolaren Konzentrationen des Herbizids Norflurazon aus. Ein mutiertes Phytoene-Desaturasegen (pds) von Haematococcus pluvialis kann diesen Effekt verhindern und wurde deshalb als Selektionsmarker für die Transformation der Mikroalgen in die binären Vektoren pCAMBIA 1301 und 1380 einkloniert. Die A. tumefaciens-vermittelte Transformation von P. lutheri und P. purpureum mit den Vektoren pCAMBIA 1301-pds-L504R und pCAMBIA 1380-pds-L504R führte zu Norflurazon-resistenten Algenzellen. Folgende Parameter, von denen bekannt ist, dass sie Einfluss auf die A. tumefaciens-vermittelte Transformation haben, wurden untersucht: das Co-Kultivierungsmedium, die Acetosyringonekonzentration und die Co-Kultivierungsdauer. Die höchste Anzahl von Norflurazon-resistenten P. lutheri-Algenzellen nach einer Transformation wurde durch Co-Kultivierung von A. tumefaciens mit pCAMBIA 1301-pds-L504R in ASW-Medium mit 100 µM Acetosyringone bei 25 ± 1ºC und Dauerlicht mit einer Bestrahlungsintensität von 10 ± 2 µmol m-2 s-1 erzielt. Für P. purpureum wurden als optimale Co-Kultivierungsparameter eine 72-stündige Anzucht in ASW+IM Medium mit 300 µM Acetosyringone ermittelt. Selbst ohne Selektion hielten Norflurazon-resistenten Algen ihren resistenten Phänotyp über mindestens 24 Monate aufrecht. Diese Ergebnisse belegen eindeutig die Eignung des pds-Gens als dominierenden Selektionsmarker für P. lutheri and P. purpureum. Das natürliche pds-Gen besitzt mehrere Introns, wodurch die Gesamtlänge der Expressionskassette, einschließlich des Promotor und Terminator, mehr als 6 kB beträgt. Daher ist das pds-Gen als Standardselektionsmarker ungeeignet. Aus diesem Grund wurde ein synthetisches pds-Gen (syn-pds-int) mit geeigneten Restriktionsschnittstellen konstruiert, in dem Introns und unerwünschte interne Restriktionsschnittstellen entfernt wurden. Nahe dem 5‘-Ende wurde das erste Intron des Chlamydomonas reinhardtii rbcS2 Gens eingefügt, ohne damit die Sequenz der Aminosäuren zu verändern. Das syn-pds-int Gen wurde unter Kontrolle seines natürlichen Promotors in pCAMBIA 1380 einkloniert und als Werkzeug für die Agrobacterium-vermittelte gentechnische Veränderung von P. purpureum eingesetzt. Es wurde eine mit dem pds-Gen vergleichbare Transformationseffizienz und letale Norflurazonkonzentration festgestellt, was darauf hinweist, dass die Funktion des synthetischen Konstrukts des pds-Gens trotz der Modifikationen erhalten blieb. Mittels PCR-Analyse von T-DNA-Sequenzen in der genomischen DNA Norflurazon-resistenter Algen sowie durch Southern-Blot-Analysen mit T-DNA-Sequenzen als Sonden konnte die Integration der eingeführten Gene ins Genom nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Untersuchungen der Stabilität der erzielten Resistenz gegenüber Norflurazon sowie von qRT-PCR-Analysen zeigten, dass das übertragene Gen effektiv exprimiert wurde. Außerdem erhöhte die Expression von PDS bei transformierten Algen die intrazelluläre Anreicherung von Carotinoiden, was die Möglichkeit eröffnet, die kommerzielle Carotinoidproduktion durch Algen biotechnologisch zu steigern. Kurzgefasst wurde eine einfache und zuverlässige Transformationsmethode für P. lutheri and P. purpureum entwickelt. Die Etablierung des A. tumefaciens-Protokolls und des synthetischen Resistenzmarkers (syn-pds-int) ist sehr wertvoll für weitere genetische Modifikationen dieser und andere biotechnologisch vielversprechender Mikroalgen.

DOI
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