Einfluss von Thrombin auf den neuronalen A-beta-Peptid-Stoffwechsel in vitro

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2010-01-08
Issue Year
2009
Authors
Behzad, Ali
Editor
Abstract

Background and Objectives Increasing evidence in recent years suggests that the pathological deposition of beta-amyloid peptides in Alzheimer dementia is linked to recurrent vascular events, blood-barrier dysfunction. Thus, factors of the coagulation pathway might be involved in the pathological deposition of A-beta. The objective of this study was to investigate the impact of thrombin on the A-beta peptide metabolism. For this purpose, a new serum-free neuronal cell culture system was established. Methods Chicken neurons and neuroblastoma cells were treated with thrombin, thrombin receptor agonists (TRAP) and geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), a substrate in the thrombin receptor cascade. Released A-beta peptides were analysed by A-beta-SDS-PAGE/Western immunoblot. Following immunodetection and visualization by chemiluminescence and digital imaging with a CCD camera, the amount of A-beta peptides was assessed semiquantitatively using a dilution series of synthetic A-beta peptides and the Quantity One software. Results Treatment of neuroblastoma cells with thrombin showed no effect on the A-beta metabolism. In chicken neurons, retractions of the neurites were observed in thrombin and TRAP treated cultures. Moreover, it was shown that chicken neurons that were cultured in serum-free media present a change of their A-beta secretion pattern during maturation. Again thrombin did not influence the A-beta secretion pattern in primary chicken telencephalic neurons. Nevertheless, using GGPP, a selective increase of the amyloidogene A-beta-42 could be shown in a dose dependent manner. Conclusions For investigations on the A-beta metabolism, a suitable serum-free cell culture system was established, offering a good alternative to already existing models. The sole binding of thrombin to the thrombin receptor – although leading to a neurite retraction – was not sufficient to stimulate the intracellular cascade which leads to a modification of the A-beta secretion. Thus, possibly other mechanisms are also involved in the deposition of beta-amyloid after vascular events. Further investigations are necessary to show, which soluble or cellular factors in the healthy central nervous system inhibit the A-beta secretion and which promote it after trauma.

Abstract

Hintergrund und Ziele Es gibt in den letzten Jahren immer mehr Hinweise darauf, dass bei der Demenz vom Alzheimer Typ (AD) die pathologischen Ablagerungen von Amyloid-beta-Peptiden (im Weiteren als A-beta bezeichnet) mit rezidivierenden vaskulären Ereignissen und Schrankenstörungen vergesellschaftet sind und Gerinnungsfaktoren hierbei eine entscheidende Rolle spielen. Die vorliegende Arbeit hatte daher das Ziel, die Wirkung der Serinprotease Thrombin, das zentrale Glied der Gerinnung, auf den A-beta-Stoffwechsel zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde ein serumfreies neuronales Zellkulturmodell etabliert. Methoden Hühnerneurone und Neuroblastomzellen wurden mit Thrombin, Thrombin-Rezeptor-Agonisten (TRAPs) und Geranylgeranyl-Pyrophosphat (GGPP), einem Substrat in der Thrombin-Rezeptor-Kaskade, behandelt. Nach Aufarbeitung der Zellkulturüber-stände wurden die einzelnen A-beta-Peptide mittels A-beta-SDS-PAGE/Westernimmuno-blot getrennt. Die Peptidmengen und das Verhältnis der einzelnen A-beta-Peptide zu-einander wurden nach Proteintransfer und Antikörpermarkierung mit Hilfe einer CCD-Kamera Lumineszenz-basiert visualisiert und mit Hilfe der Quantitiy One Software und einer Verdünnungsreihe synthetischer Standard-A-beta-Peptide semi-quantitativ ausgewertet. Ergebnisse Die Behandlung der SY5Y-Neuroblastomzellen mit Thrombin zeigte keine Wirkung auf den A-beta-Stoffwechsel. Bei den Hühnerneuronen konnte eine Retraktion von Zell-Ausläufern durch Thrombin-Behandlung und TRAPs gezeigt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass Hühnerneurone, die in serumfreiem Medium kultiviert wurden, im Laufe ihrer Differenzierung eine Veränderung des A-beta-Sekretionsmusters aufweisen. Auf den A-beta-Stoffwechsel hatten Thrombin und TRAP jedoch auch in der Hühnerneuronenkultur keinen Einfluss. Eine selektive Erhöhung des amyloidogenen A-beta1-42 konnte jedoch dosisabhängig mit GGPP erreicht werden. Praktische Schlussfolgerungen Ein neues, serumfreies Zellkultursystem konnte etabliert werden, das sich gut zur Untersuchung des A-beta-Stoffwechsels eignet und eine gute Alternative zu bereits bestehenden Modellen bietet. Die weiteren Ergebnisse zeigten, dass – obwohl Thrombin zur Retraktion von Neuriten führt – die alleinige Aktivierung des Thrombin-Rezeptors nicht ausreicht, um die intrazelluläre Signalkaskade in Gang zu setzen, die zu einer veränderten A-beta-Sekretion führt. Möglicherweise sind somit auch bei der beta-Amyloid-Ablagerung nach vaskulären Ereignissen andere Mechanismen an der A-beta-Übersekretion beteiligt. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche löslichen oder zellulären Faktoren im gesunden ZNS eine A-beta-Sekretion verhindern und welche nach Traumata die Sekretion begünstigen.

DOI
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