The Role of Sensory Neuropeptides during Experimental Hepatitis

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-04-21
Issue Year
2009
Authors
Kröger, Irena
Editor
Abstract

In the last years increasing evidence suggests an interrelation between autonomic nervous and immune system (Mignini et al., 2003). A contribution of nerve fibres in inflammatory processes is well established and has been investigated in many organs, e.g. in autoimmune mediated hepatitis in mice (Neuhuber and Tiegs, 2004). Moreover, in this context, it seems that SP and CGRP, which were released from the same primary afferent C fibres, play an important role (Holzer, 1988; Maggi, 1995). Previous studies already revealed an essential role of peptidergic primary sensory neurons and its neuropeptides SP in experimental immune hepatitis in mice (Bang et al., 2003; Bang et al., 2004). But the role of CGRP remains unknown. The expression of CGRP has already been detected in normal liver, and it is synthesized by primary hepatocytes in cultures (Bracq et al., 1994). Comprehensive innervation with CGR-positive nerve fibres of the liver was shown (Tiegs et al., 1999). Therefore, the aim of this study was to elucidate its function during liver inflammation. In the first part of the study, expression as well as cellular distribution of the CGRP receptor in the mouse liver had to be examined. Therefore, murine liver tissue was analyzed by RT-PCR, sequencing analyses and FACS staining experiments. The receptor subunits were verified in the whole liver, especially on hepatocytes, macrophages and B cells. During GalN/LPS mediated liver injury, the CGRP receptor expression was increased on hepatocytes and macrophages whereas the CGRP concentration was diminished. This concludes an interference of induced liver injury with CGRP. Secondly, with respect to the functional activity during liver inflammation, the role of endogenous CGRP had to be investigated by using CGRP receptor antagonists and a CGRP-binding Spiegelmer®. Pretreatment with either CGRP8-37, BIBN4096BS or CGRP-binding Spiegelmer® failed to reduce GalN/LPS-induced liver injury and tended to increase liver inflammation at higher doses, indicating that endogenous CGRP, if at all, might regulate liver inflammation. Exogenously administered CGRP significantly prevented inflammatory liver injury in GalN/LPS-, ConA- and GalN/anti-CD3-induced hepatitis. This protective effect was reflected by significantly reduced inflammatory parameters like plasma transaminase activities as well as TNFa levels and the partly increased anti-inflammatory IL-10 levels. A lack of protection was found upon GalN/TNFalpha treatment. Therefore, it seems that the overall effect of CGRP in the liver is on the macrophage level. In the third part of this study, possible mechanism should be identified regarding the protective effect of CGRP. Experiments with IL-10-/- mice also revealed a protective effect of CGRP which argues for an IL-10-independent anti-inflammatory effect of CGRP. In spite of that, IL-10 might play a supporting role in the protective effect of CGRP. Furthermore, the expression of the inducible cAMP early repressor was investigated. CGRP induced the intrahepatic expression of ICER as assessed at an early time point following GalN/LPS administration correlating with TNFa peak concentrations. This result indicates that CGRP might have directly prevented TNFa promoter activation by induction of ICER. Additionally performed in vitro experiments with primary hepatocytes and the macrophages cell line RAW 264.7 showed no protective effects of CGRP. But in vitro experiments only incompletely represent a complex organic process. Although efforts have been made to adjust in vitro concentrations to possible in vivo conditions, one can not guarantee similar effects. Furthermore, frequency analyses of different cell types were investigated. Frequency changes were found in macrophages and granulocytes 4 and 6 hours after GalN/LPS administration. A high amount of granulocytes after CGRP pretreatment underwent apoptosis upon CGRP pretreatment, which was shown by Annexin V staining. Frequency increase of macrophages after CGRP treatment did not aggravate inflammation. It can be speculated that these macrophages had the phenotype of so called type II activated macrophages which were recently identified to produce large amounts of IL-10. Experiments with CGRP-/- mice disclosed divergent results. Like expected, ConA administration resulted in a dramatically increased liver damage in KO mice compared to wt mice whereas GalN/LPS challenge caused a lower liver damage in the KO mice. This result cannot be explained at present. In conclusion, the results of the present study provide compelling evidence for a protective effect of CGRP in immune-mediated liver injury. CGRP seems to prevent inflammatory liver damage by IL-10-independent ICER-dependent inhibition of TNFa production but not by interfering with TNFa induced hepatocyte apoptosis.

Abstract

In den letzten Jahren deuteten mehrere Hinweise auf ein Zusammenspiel zwischen dem autonomen Nervensystem und dem Immunsystem hin. Der Einfluss von Nervenfasern bei Entzündungsprozessen ist bekannt und wurde bereits in vielen Organen untersucht, u. A. bei der Autoimmunhepatitis in Mäusen. In diesem Zusammenhang wurden SP und CGRP, die aus den gleichen primärafferenten C-Fasern freigesetzt werden, eine bedeutende Rolle zugeordnet. Vorherige Studien zeigten, dass peptidergen primären sensorische Neuronen und ihrem Neuropeptide SP eine wichtige Rolle in der experimentellen Immunhepatitis in Mäusen zukommt. Die Funktion des Neuropeptids CGRP in diesem Zusammenhang blieb ungeklärt. Die CGRP Expression wurde bereits in der gesunden humanen Leber gezeigt, wie auch dessen Synthese durch primäre Hepatozyten in vitro. Auch eine reichhaltige Innervation der Leber mit CGRP-positiven Nervenfasern war bekannt. Daher war das Ziel vorliegender Arbeit, die Funktion und Wirkung von CGRP während einer Leberentzündung zu untersuchen. Zunächst sollte das Vorkommen des CGRP-Rezeptors in der Mausleber überprüft werden. Zusätzlich sollten Leberzellen analysiert werden, um die Rezeptorexpression auf den einzelnen Zellen zu identifizieren. Dazu wurde murines Lebergewebe mittels RT-PCR, Sequenzierungen und FACS-Analysen untersucht. Einzelne Rezeptorkomponenten wurden in der Gesamtleber, die CGRP-bindende Komponente auf Hepatozyten, Makrophagen und B-Zellen nachgewiesen. Mausversuche mit GalN/LPS-vermittelter Leberschädigung zeigten eine erhöhte Rezeptorexpression auf Hepatozyten und Makrophagen und eine Abnahme der intrahepatische CGRP Konzentration während der Schädigung. Folglich werden CGRP und sein Rezeptor bei einem Leberschaden beeinflusst. Aufgrund dieser funktionellen Aktivität sollte im zweiten Teil dieser Arbeit die Funktion des endogenen CGRPs unter Verwendung von Rezeptorantagonisten und eines CGRP-Bindungs-Spiegelmers® untersucht werden. Diese Vorbehandlung konnte weder mit CGRP8-37, BIBN4096BS noch dem CGRP-Bindungs-Spiegelmer® eine Reduktion des GalN/LPS- induzierten Leberschadens erreichen. Im Gegenteil, die Leberentzündung schien durch höhere Dosen eher verstärkt zu werden. Endogenes CGRP könnte demnach eine Leberentzündung regulieren. Die exogene Gabe von CGRP im GalN/LPS-, ConA- und GalN/anti-CD3- Mausmodell verhinderte eine Leberentzündung. Dieser Schutz wurde durch signifikant reduzierte Entzündungsparameter reflektiert. Das Fehlen eines Schutzeffektes im GalN/TNFa Mausmodel legte nahe, dass CGRP keinen direkten Effekt auf Hepatozyten ausübt. Im letzten Abschnitt dieser Studie sollten mögliche Mechanismen für einen anti-inflammatorischen CGRP-Effekt identifiziert werden. Ein IL-10 Einfluss wurde mittels einer CGRP-Vorbehandlung von IL-10-/- Mäuse im GalN/LPS induzierten Leberschaden untersucht. Auch hier konnte ein protektiver CGRP-Effekt beobachtet werden, so dass von einer IL-10 unabhängigen anti-inflammatorischen CGRP-Wirkung ausgegangen werden konnte. Allerdings könnte IL-10 trotzdem den schützenden CGRP Effekt unterstützen und damit verstärken. Auch die Expression von ICER wurde untersucht. Durch eine CGRP-Vorbehandlung wurde im GalN/LPS-Model die intrahepatische ICER Expression induziert, welche mit der verringerten TNFa Konzentration zu diesem Zeitpunkt korrelierte. Möglicherweise verhindert CGRP durch die ICER Induktion direkt eine TNFa Promotor Aktivierung. Zusätzliche in vitro Experimente mit primären murinen Hepatozyten und der Makrophagen Zelllinie RAW 264.7 zeigten keinen anti-apoptotischen und auch keinen zytokinhemmenden Effekt durch CGRP. Hierbei muss allerdings berücksichtigt werden, dass in vitro Experimente nur unvollständig einen komplexen Organismus darstellen können. Auch ein möglicher Effekt von CGRP auf die Frequenz verschiedener Zelltypen wurde untersucht. Erhöhte Zellzahlen wurden für Makrophagen und Granulozyten 4 und 6 Stunden nach der GalN/LPS Gabe beobachtet. Die Granulozyten waren hierbei bereits in Apoptose, was durch Annexin V-Färbung nachgewiesen werden konnte. Die erhöhte Makrophagenanzahl muss nicht entscheidend für eine Verschlechterung der Entzündung sein. Es könnte sich um so genannte Typ II aktivierte Makrophagen handeln, die kürzlich entdeckt wurden und viel IL-10 produzieren. CGRP-/- Maus Experimente zeigten gegensätzliche Ergebnisse. Die ConA Gabe resultierte in einen dramatisch erhöhten Leberschaden in den KO Mäusen wohingegen die GalN/LPS Gabe einen verringerten Schaden in den KO Mäusen verursachte. Diese Ergebnisse können derzeit noch nicht erklärt werden. Zusammengefasst zeigte diese Studie, einen CGRP-Schutz-Effekt in der immun-vermittelter Leberschädigung. CGRP scheint über eine IL-10 unabhängige, ICER-abhängige Hemmung der TNFa Produktion zu wiken, nicht aber durch Abschwächung der TNFa induzierbaren hepatozellulären Apoptose.

DOI
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