Mutationsanalyse von Axin 2/ Conductin bei Patienten mit Hypophysenadenomen und Kraniopharyngeomen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2013-07-22
Issue Year
2013
Authors
Stangl, Regina Maria
Editor
Abstract

Background and aims: So far the pathogenesis of pituitary adenomas and craniopharyngiomas has not been completely detected. In both of the tumors located in or near the sella turcica deregulated signalling pathways, which seem to play a significant role in their pathogenesis. Single mutations, deletions, insertions, rearrangements or missense mutations have been shown for APC, Axin, GSK3β and β-catenin, all coding for ligands of the Wnt-signaling pathway. As an important component conductin regulates among others the degradation of β-catenin. In case of high β-catenin levels the transcription of Wnt responsive genes is mediated with the help of transcription factors (LEF-1/TCF-family). This research can be divided in two parts, the immunohistochemical staining and the gene analysis. First accumulations of β-catenin were detected immunohistochemically in a group of tumor specimens consisting of craniopharyngiomas and pituitary adenomas. Because of the discrepancy between the mutation frequency in the β-catenin gene (80%) and the immunohistochemical accumulations (94%) in the tumor cell nuclei a mutation analysis of the conductin-gene was subsequently performed. Methods: The tumor specimens which were examined were obtained by transsphenoidal surgery. Their DNA was extracted using standardized techniques and subsequently amplified by PCR. Afterwards the DNA was thermally denatured and separated according to the different molecular sizes in the electric field onto polyacrylamid gels. The single-string alterations that were detected using the SSCP method, were cut out of the polyacrylamid gels and sequenced in order to find mutations in the nucleotid sequence in the exons of the DNA. The immunohistochemical staining was performed using a monoclonal antibody against β-catenin. Results: Mutations of the nucleotid sequence were found in the pituitary adenomas of four exons for the protein-coding sequence. A mutation that has already been described in the literature was detected for the primer 1.4 in a patient with ACTH producing pituitary adenoma. Therefor the protein structure of the conductin was altered. In the case of three patients with adamantinomatous craniopharyngioma using the primer 5.2 we detected a synonymous or “silent” substitution. Equally “silent” substitutions could be detected with the primer 5.3 in a patient with papillary craniopharyngioma and the primer 7.3 in six other patients with adamantinomatous craniopharyngioma. Using the primers 5.4, 6.2 and 7.1 we detected intronic mutations in 18 specimens of craniopharyngiomas and in 20 cases of pituitary adenomas. Healthy tissue samples showed alterations for primer-sections 5.4., 6.2, 7.1 and 7.3 but not as frequently as tumor tissue. Conclusions: In this study a mutation in a conductin gene in a patient with ACTH-producing pituitary adenoma was discovered, this mutation has already been described. The frequent intronic mutations of the nucleotid sequence were considered conspicuous. The impact of these on the functionality of conductin should be examined in future studies. Mutations of conductin do not explain the discrepancy between the accumulation of β-catenin and the existence of mutations in the β-catenin gene. Therefore it remains to be examined to what extent other mutations of components of the signaling pathway are involved in and influence the development of pituitary adenomas and craniopharyngiomas.

Abstract

Hintergrund und Ziele: Bisher konnte die Pathogenese von Hypophysenadenomen und Kraniopharyngeomen nicht endgültig eruiert werden. Bei diesen innerhalb oder in der Nähe der Sella turcica lokalisierten Tumorentitäten scheinen in der Pathogenese deregulierte Siganalkaskaden beteiligt zu sein. So konnten einzelne Mutationen, Deletionen, Insertionen, Rearrangements oder Missense-Mutationen für APC, Axin, GSK3β und β-Catenin, die für Liganden des Wnt-Signalwegs kodieren, nachgewiesen werden. Conductin als wichtige Komponente reguliert unter anderem den Abbau des β-Catenins. Bei hohen β-Catenin-Spiegeln wird über Transkriptionsfaktoren (LEF-1/TCF-Familie) die Transkription Wnt-responsiver Gene vermittelt. Die vorliegende Arbeit lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen. Zunächst wurden immunhistochemisch β-Catenin-Anreicherungen in einem Tumorkollektiv aus Kraniopharyngeomen und Hypophysenadenomen detektiert. Aufgrund der Diskrepanz zwischen Mutationshäufigkeiten innerhalb des β-Catenin Gens (80%) und der nachweisbaren immunhistochemischen Akkumulationen (94%) in den Tumorzellen, wurde eine Mutationsanalyse des Conductin Gens angeschlossen um gegebenenfalls genetische Alterationen nachzuweisen. Methoden: Die untersuchten Tumorproben wurden bei transsphenoidalen Eingriffen gewonnen. Mit standardisiertem Verfahren konnte DNA extrahiert und anschließend durch PCRs amplifiziert werden. Danach wurde die DNA thermisch denaturiert und im elektrischen Feld auf Polyacrylamidgelen nach ihren unterschiedlichen molekularen Größen aufgespaltet. Die mittels SSCP-Verfahrens detektierten, aberrant angeordneten Banden wurden aus den Polyacrylamidgelen ausgeschnitten und anschließend sequenziert, um veränderte Basenabfolgen in den Exonabschnitten der DNA aufzudecken. Die immunhistochemische Färbung erfolgte mittels eines kommerziellen monoklonalen Antikörpers gegen β-Catenin. Ergebnisse: In den Hypophysenadenomen wurden in vier Genabschnitten Basenveränderungen in kodierenden Bereichen gefunden: Für den Primer 1.4 konnte eine in der Literatur bereits beschriebene Mutation bei einem Patienten mit ACTH-produzierendem Hypophysenadenom detektiert werden. Durch diese Punktmutation wird die Proteinstruktur des Conductins verändert. Der Primerbereich 5.2 enthält bei drei Patienten mit adamantinösem Kraniopharyngeom eine synonyme oder „stille“ Substitution. Ebenso konnten „stille“ Substitutionen im Primerabschnitt 5.3 bei einem Patienten mit papillärem Kraniopharyngeom und im Abschnitt 7.3 bei weiteren sechs Patienten mit adamantinösem Kraniopharyngeom detektiert werden. Die Primerabschnitte 5.4, 6.2 und 7.1 enthielten in insgesamt 18 Kraniopharyngeomproben und in 20 Hypophysenadenomproben intronische Veränderungen. Die Kontrollproben zeigten in den Abschnitten 5.4, 6.2, 7.1, und 7.3 ebenfalls Basenveränderungen, diese traten jedoch mit geringerer Häufigkeit auf. Schlussfolgerung: In dieser Arbeit konnte eine Mutation im Conductin Gen bei einem Patienten mit einem ACTH-produzierendem Hypophysenadenom gefunden werden. Des Weiteren waren die gehäuft auftretenden intronischen Basenveränderungen in anderen amplifizierten Sequenzen auffällig. Ob diese Einfluss auf die Funktionalität des Conductins haben, muss in weiterführenden Studien geklärt werden. Conductin-Mutationen erklären somit nicht die Diskrepanz zwischen β-Catenin Anreicherungen und dem Auftreten von Mutationen im β-Catenin Gen. In welchem Grad andere mutierte Komponenten der Signalkaskade beteiligt sind und die Entstehung der Hypophysenadenome und Kraniopharyngeome beeinflussen, bleibt zu untersuchen.

DOI
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