Epigenetic Regulation of V(D)J Recombination in Early B Cell Development

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Doctoral Thesis
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Lang, Stefan

The highly variable immunoglobulin (Ig) and T-cell receptor (TCR) genes are assembled by a somatic recombination process called V(D)J recombination. V(D)J recombination is restricted to the early stages of B and T cell development, as the crucial RAG enzyme is expressed only in these cells. The recombination process is regulated in a strictly lineage and stage speciffic way. In the first recombination step, proB cells recombine the Ig heavy chain locus (IgH ), whereas proT cells only partially recombine the IgH locus and completely recombine the TCRbeta, the TCRdelta and the TCRgamma locus. As the RAG enzyme is expressed in proB and proT cells, the lineage specificity of V(D)J recombination has to be regulated by the differential accessibility of the Ig and TCR loci. The accessibility of promoter elements for the transcription machinery correlates with the posttranslational acetylation of histone H3 (H3Ac) and the posttranslational di-methylation of histone H3 at lysine 4 (H3K4Me2). As these modification also correlate with general accessibility, and furthermore germline transcription at the recombination competent loci was the first hint towards differential accessibility, we created a high resolution map of H3Ac and H3K4Me2 modified chromatin domains across the Ig and TCR loci. To investigate, whether the loci that are competent for V(D)J recombination show open chromatin modifications, or whether the loci that are excluded from V(D)J recombination show closed chromatin modifications, the histone H3 lysine 9 tri-methylation (H3K9Me3) that is associated with heterochromatin formation was also analyzed. The results of this work demonstrate that the recombination potential of the Ig and TCR loci correlates with strong H3Ac and H3K4Me2 modifications at the recombination competent J cluster in proB and proT cells from Rag knockout mice. Only the JH segments show H3K9Me3 marks in addition to the H3Ac and H3K4Me2 modifications in proB and proT cells. At the V segments comparable levels of histone modifications were detected in proB and proT cells. Functionally, the level of H3Ac and H3K4Me2 modification at the VH J558 segments does not correlate with the recombination rate of these segments. Contrary to the VH segments, three chromatin domains at the VH cluster (IVARs) show the open chromatin marks H3Ac and H3K4Me2 only in proB cells. In addition to the chromatin configuration, one IVAR element shows weak promoter activity in a reporter gene assay using a proB cell-line. Therefore, neither the idea that complete V clusters or individual V segments become epigenetically activated for V(D)J recombination by the deposition of H3Ac or H3K4Me2 marks nor the idea that V clusters or V segments are epigenetically excluded from V(D)J recombination by the deposition of H3K9Me3 marks are supported by this work. It has been published that the IgH locus is contracted during V(D)J recombination and this locus contraction is not mediated by the RAG enzyme. Furthermore, it has been shown that anti-sense transcripts correlate with the V(D)J recombination at the IgH locus. Both observations are included into a hypothetical model of V(D)J recombination using the model of transcription factories. A transcription factory is a chromosomal synapse including several active promoter elements. The polymerases are located inside these factories and instead of traveling along the chromatin template upon transcription, the chromatin is dragged into the factory. In this hypothetical model of V(D)J(H) recombination presented here, the distal VH segments become activated for V(D)J recombination, because one of the IVAR promoters associates with the JH containing transcription factory. The RNA polymerase associated with the IVAR would drag distal VH segments close to the JH cluster and this proximity would enable the distal VH segments to participate in V(D)J recombination. I propose that VH germline transcription is a prerequisite for the activation of distal VH segments.


Die Immunglobulin (Ig) - und T-Zell-Rezeptor (TCR) - Genorte werden nur im Zuge der B- und T-Zell Entwicklung umgelagert, da nur in diesen Zellen das notwendige RAG Enzym gebildet wird. Die Ig-Genorte werden nur in B-Zellen und die TCR-Genorte nur in T Zellen vollständig umgelagert obwohl das RAGEnzym in beiden Zelltypen aktiv ist. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass die V(D)J Rekombination über die zelltypspezifische Zugänglichkeit der Ig- und TCR-Genorte reguliert wird. Die Zugänglichkeit für den Transkriptionsapparat korreliert mit posttranslationalen Modifikationen der Histone, wie der Histon H3 Acetylierung (H3Ac) und der Dimethylierung am Lysin 4 des Histon H3 (H3K4Me2). Da zeitgleich zur V(D)J-Rekombination auch sterile Transkripte an den Ig und TCR Genorten gefunden werden, wurden in dieser Arbeit die H3Ac und H3K4Me2 Modifikationen in hoher Auflösung an den Ig- und TCR-Genorten kartiert. Um zu analysieren, ob die Genorte in rekombinationskompetenten Zellen geöffnet, oder in nicht kompetenten Zellen verschlossen werden, wurde zusätzlich zu den mit zugänglichem Chromatin korrelierten Modifikationen die Histon H3 Lysin 9 tri-Methylierung (H3K9Me3) analysiert, die mit unzugänglichem Chromatin korreliert. Der erste Rekombinationsschritt in proB Zellen ist die VDJ Rekombination der schweren Kette (IgH Lokus), wohingegen in proT Zellen der IgH Lokus teilweise umgelagert wird (DJ) und die Genorte der beta Kette (TCRbeta), der delta Kette (TCRdelta) und der gamma Kette (TCRgamma) vollständig umgelagert werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass in Zellen, die die RAG-Rekombinase nicht exprimieren können (Rag KO) alle rekombinationskompetenten J Segmente in ausgedehnten Chromatin Domänen liegen, die ausgeprägte H3Ac und H3K4Me2 Modifikationen zeigen. Nur die JH Segmente zeigen zusätzlich H3K9Me3 Modifikationen in proB und proT Zellen. Rekombinationskompetente V Segmente zeigen deutlich weniger H3Ac und H3K4Me2 Modifikationen, die am IgH Genort nicht mit der Fequenz korrelieren, in der VH Segmente in VDJH Rekombinationsereignissen gefunden werden. Im Gegensatz zu den VH Segmenten zeigen drei intergene Regionen in der distalen VH Region (IVARs) starke H3Ac und H3K4Me2 Modifikationen. Hier wird gezeigt, dass das am weitesten proximal gelegene IVAR Element schwache Promoter Aktivität hat. Daher sprechen die Daten in dieser Arbeit weder für eine epigenetisch regulierte Öffnung der V Regionen auf Basis von H3Ac oder H3K4Me2 Modifikationen an den V Segmenten, noch für den epigenetischen Ausschluss einzelner Genorte von der V(D)J Rekombination auf der Basis von H3K9Me3 Modifikationen an den V Segmenten. Es wurde publiziert, dass der IgH Genort zum Zeitpunkt der Rekombination in Schleifen gelegt wird ('locus contraction') und aktive Transkription vom komplementären Strang der DH Region und der VH Region stattfindet. Die Schleifenbildung und die Transkription könnten funktionell gekoppelt sein, da Orte aktiver Transkription in vivo zu sogenannten 'transcription factories' zusammengelegt werden. Da die RNA-Polymerasen in diesen Fabriken fest verankert sind, würde der Prozess der Transkription die distalen DH Segmente und die VH Segmente in die Nähe der JH Segmente bringen. In dem hier aufgestellten Modell werden die IVAR Elemente auf Grund der Transkription in die 'transcription factory' eingebunden, in der auch die JH Segmente eingebunden sind. Die IVAR Elemente wären somit für die Aktivierung der distalen VH Segmente verantwortlich. Erst aufgrund der Nähe könnten die distalen VH Segmente an die JH Segmente rekombiniert werden. Dieses Modell verknüpft die Transkription an der distalen VH Region funktionell mit der V(D)J Rekombination der in diesen Regionen gelegenen Elemente.

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