Gene der Cardenolid-Biosynthese aus Digitalis- und Isoplexis-Spezies

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2006-12-12
Issue Year
2006
Authors
Herl, Vanessa Jeannine
Editor
Abstract

This thesis focused on the enzymes 5-3ß-hydroxysteroid dehydrogenase (3ß-HSD) and progesterone 5ß-reductase (5ß-POR), both involved in cardenolide biosynthesis in the genera Digitalis and Isoplexis. 5ß-POR genes from 19 Digitalis species/subspecies and 4 Isoplexis species were amplified, cloned and sequenced, using specific primers and corresponding DNA or cDNA, respectively. The nucleotide sequences as well as the deduced amino acid sequences showed a high degree of homology (96 %). All 5ß-POR sequences obtained were published in GenBank NCI Database. Southern blot analysis identified 5ß-POR from D. lanata to be a member of a small gene family. Using 5ß-POR genes of selected Digitalis and Isoplexis species, a phylogram was constructed, elucidating phylogenetic relationships between the genera Digitalis and Isoplexis. With a view to characterising 5ß-POR from D. lanata further, the enzyme was heterologously expressed in E. coli as a recombinant His-tagged protein (r5ßPOR). Optimised conditions for protein expression facilitated the expression of r5ß-POR in a soluble and functional form. The His-tagged r5ß-POR was purified under native conditions and afterwards characterised with regard to substrate specificity, kinetic constants and biochemical properties. To elucidate the 3-D structure of the enzyme, r5ß-POR as well as SeMet-r5ß-POR was produced. Taking the structural and biochemical properties of the enzyme into account, 5ß-POR was identified as a new member of the short-chain dehydrogenase/reductase family (SDR). With the purpose of cloning 3ß-HSD genes from Digitalis and Isoplexis, PCR/RTPCR amplifications were carried out using specific primers and DNA or cDNA of several Digitalis and Isoplexis species, respectively. In this process 3ß-HSD genes from 7 Digitalis species were successfully amplified, cloned and sequenced. The nucleotide sequences obtained as well as the amino acid sequences deduced showed a high degree of homology (95 %). All 3ß-HSD sequences have been published in GenBank NCI Database. Subsequent 3ßHSD from D. lanata was functionally expressed in E. coli as a recombinant His-tagged protein (r3ß-HSD). After purification of the recombinant enzyme under native conditions, r3ß-HSD was characterised. Structural and biochemical properties of the 3ß-HSD classified this enzyme, as in the case of 5ß-POR, as a member of the short-chain dehydrogenase/reductase family (SDR).

Abstract

In der vorliegenden Arbeit standen die an der Biosynthese der Cardenolide in Digitalis und Isoplexis beteiligten Enzyme _5-3ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3ß-HSD) und Progesteron-5ß-Reduktase (5ß-POR) im Mittelpunkt der Untersuchungen. Unter Verwendung von spezifischen Primern und DNAs bzw. cDNAs verschiedener Digitalis- und Isoplexis-Arten wurden die 5ß-POR Gene aus 19 Digitalis-Spezies, bzw. Subspezies und 4 Isoplexis-Spezies amplifiziert, kloniert und sequenziert. Sowohl die erhaltenen 5ß-POR Nukleotidsequenzen, sowie die daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzenwiesen mit 96 % Homologie ein hohes Maß der Übereinstimmung auf. Alle klonierten 5ß-POR Sequenzen wurden in der Genbank NCI Database veröffentlicht. Die durchgeführte Southern-Blot-Analyse konnte die 5ß-POR in D. lanata als ein Mitglied einer kleinen Genfamilie identifizieren. Zur Aufklärung verwandtschaftlicher Beziehungen der Digitalisund Isoplexis-Arten wurde ein Phylogramm basierend auf den 5ß-POR Gensequenzen ausgewählter Digitalis- und Isoplexis-Spezies erstellt. Um die 5ß-POR aus D. lanata weiter charakterisieren zu können, wurde das Enzym als His-tag Fusions-Protein in E. coli heterolog überexprimiert (r5ß-POR). Bei optimalen Expressionsbedingungen war es möglich, die r5ß-POR in löslicher und funktioneller Form zu exprimieren. Die nativ His-tag gereinigte r5ß-POR wurde bezüglich ihrer Substratspezifität, kinetischen Parameter und biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Zur Aufklärung der 3D-Struktur des Enzyms wurde sowohl r5ß-POR, als auch SeMet-r5ß-POR hergestellt. Unter Berücksichtigung der strukturellen und proteinchemischen Eigenschaften wurde die 5ß-POR der Enzym-Superfamilie der Short- Chain-Dehydrogenases/Reductases (SDR) zugeordnet. Zur Klonierung der 3ß-HSD wurden PCRs, bzw. RT-PCRs mit spezifischen Primern und DNAs, bzw. cDNAs verschiedener Digitalis- und Isoplexis-Arten durchgeführt. Es konnten die 3ß-HSD Gene aus 7 Digitalis-Spezies amplifiziert, kloniert und sequenziert werden. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen waren, ebenso wie die daraus abgeleiteten 3ß-HSD Aminosäuresequenzen, zu 95 % homolog. Die klonierten 3ß-HSD Sequenzen wurden in der Genbank NCI Database veröffentlicht. Die 3ß-HSD aus D. lanata konnte als His-tag Fusions-Protein in E. coli funktionell überexprimiert werden (r3ß-HSD). Nach nativer His-tag Reinigung wurde die r3ß-HSD charakterisiert. Aufgrund der strukturellen und proteinchemischen Eigenschaften der 3ß-HSD konnte das Enzym, wie die 5ß-POR, als ein Mitglied der Short-Chain-Dehydrogenase/Reductase Superfamilie (SDR) eingeordnet werden.

Citation
Phytochemistry , Planta Medica , Acta Crystallographica F
DOI
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